lncRNA,pre-miRNA,circular RNA,来看看大牛们是如何可视化的-acdbio公司新闻-蚂蚁淘厂家直采,部分现货.

原标题：lncRNA，pre-miRNA，circular RNA，来看看大牛们是如何可视化的

顾名思义，非编码核糖核酸（RNA）为不进行蛋白翻译的一类RNA。目前非编码RNA包括tRNA（转录RNA），ribosomalRNA（核糖体RNA），microRNAs，long non-coding RNAs（长链非编码）以及circular RNA等。

长链非编码RNA可视化研究的意义以及RNAscope技术在其中的广泛应用

LncRNA为长度大于200个核苷酸的非编码RNA。据统计在哺乳动物细胞基因组内约有4~9%的基因转录为lncRNAs，而蛋白编码RNA仅占基因组转录的1%。越来越多的研究证明lncRNAs可以在转录水平，转录后水平参与基因调控，同时也可以参与表观遗传调控，具有极其重要和复杂的生物学意义。

LncRNA的研究方法主要针对序列鉴定以及功能研究两大方面：

（1）序列鉴定研究。通常包括将其从组织细胞中提取出来，并通过芯片检测法，Northern印记技术，定量RT-PCR法，RNA测序法（直接测序法，转录测序法以及蛋白沉淀伴随lncRNA高通量测序法）等分析明确该长链非编码RNA的序列。

（2）功能研究。除了使用数据库以及生物工程软件进行功能预测外，主要的实验方法有：原位检测法，以观察待检测lncRNA在细胞以及组织水平的定位和分布；使用载体构建，载体转染，基因敲除等方法过表达或沉默某个长链非编码RNA，以观察其在细胞和动物体内的作用。因而，对lncRNA在细胞内的准确定位，与哪些蛋白质直接存在相互作用等等信息均需要进行原位可视化分析。

我们来看看大牛们是如何对lncRNA的功能进行原位可视化研究的？

真核细胞中，RNA转录属于一个严格调控的过程。非编码RNA参与转录活化因子，转录抑制因子，RNA聚合酶II，甚至DNA双螺旋的调控：

（1）参与转录活化因子的调控。例如长链非编码RNAEvf-2作为转录因子Dlx2的活化因子，参与神经系统的发育。为了明确其具体参与调控的脑区，Jianchi Feng等使用RNA原位杂交的方法定位发现Evf-2分布在胚胎12.5天的小鼠腹侧前脑，从而明确了这一长链非编码RNA在体内的功能作用部位[1]。

（2）参与转录后的调控。在转录后调控的过程中，长链非编码RNA可以与目标信使RNA（mRNA）结合，通过影响剪切，转导，翻译以及降解等方式对mRNA进行转录后调控。例如在神经元的轴突以及树突区域，突触激活后可以导致RNAPIII转录生成长链非编码RNA-BC1，该lncRNA可以与该区域的mRNA互补结合，从而抑制mRNA的翻译。为了明确BC1在体内的功能，Centonze D等人使用原位检测的方法定位发现BC1在纹状体GABA能神经元的轴突内表达，并参与纹状体区域GABA能神经元突触的塑型[2]。

（3）参与表观遗传调控。表观遗传修饰包括DNA甲基化，乙酰化以及泛素化等。这些修饰直接影响了染色体的生物学功能，导致大量基因被调控。最新的研究显示非编码RNA可以参与调控染色体的修饰。例如在对lncRNA repressor element-1silencing tranional factor （REST）的研究中，已知其可以通过与染色体组蛋白发生作用，从而阻止神经干细胞成熟前分化。在对REST在脊椎动物神经发育的深入研究中，Saritas-Yildirim B等人在蟾蜍中筛选出与REST潜在结合的1396个基因，并通过whole mount原位杂交的方法对REST以及重要相关靶基因在体内进行定位检测，并明确了REST与四个早期胚胎发育相关基因的分布以及相互关系[3] 。

既然原位可视化研究如此重要，要如何选择更适合的原位检测方法以完美呈现研究结果呢？请看各种原位杂交方法的比较分析。

在过去的lncRNA原位检测过程中，通常使用到荧光原位杂交法（Fluorescence in situ hybridization, FISH）或同位素原位杂交法。这两种方法分别使用荧光素或放射性同位素标记探针，通过探针与靶RNA序列互补的方法检测目标RNA。同位素法由于存在放射性物质，对实验者以及环境存在一定的放射污染，而荧光法则使得检测背景的组织结构无法呈现。更重要的是，由于这两种方法使用到的探针片段很长，而RNA靶标在检测过程中通常存在一定程度的降解，造成检测信号不稳定，背景干扰较大，从而影响RNA原位杂交检测的敏感度。

技术的进步必然助力科研的发展。与以上提到的传统原位杂交相比，近年来出现的RNAscope技术作为新一代RNA原位杂交技术，在长链非编码RNA的检测中有着不可比拟的优势。RNAscope技术及产品由美国（Advanced Cell Diagnostics, ACD; SanFrancisco, US）公司研制开发。该公司从建立之初就致力于分子病理，细胞和组织诊断领域的精准医疗，同时致力于在细胞组织水平检测单个及多个靶标RNA，并进行定量分析。RNAscope产品不同于传统的RNA原位杂交探针设计原理，拥有自己独特的探针设计以及杂交后特有的信号放大系统，使得该技术可以准确有效地在多种组织细胞类型中，例如石蜡组织切片，冰冻组织切片，悬浮细胞，贴壁细胞等敏感高效地检测到目标RNA[4]，并有效控制信噪比，使得信号的检出率比传统的RNA原位杂交的技术提升数千倍：

1. 极高的特异性：RNAscope独特的双Z（ZZ）探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z 探针不会产生完整的信号放大分子结合位点，并会在杂交过程中被洗脱掉，从而防止非特异性信号的放大，使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要2~4周时间即可完成。

2. 极好对的灵敏度：RNAscope方法检测每个RNA 分子时，只需三对双Z（ZZ）探针即可完成杂交和信号可视化，意味着可以呈现单一RNA分子。

3. 单分子可视化和单细胞定量: 使用RNAscope技术杂交上三对及以上双Z 探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内RNA 的表达水平。

4. 兼容降解的RNA: 由于RNAscope三对双Z探针即可检测到目标RNA，而通常针对靶点RNA设计的探针为20 对双Z 探针，因而即使目标RNA发生部分降解，仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。

5. 不限物种，应用广泛: 使用RNAscope技术，靶点RNA为大于等于300个碱基的特异序列，即可进行探针设计。因而RNAscope技术可以应用于几乎所有物种，所有组织以及所有基因的检测。

6. 检测结果稳定一致性：由于工业化合成RNAscope技术用到的探针以及所有检测试剂，且该技术针对不同样本类型（冰冻切片，石蜡切片，悬浮细胞，贴壁细胞等）已经有成熟的实验操作流程，故使得RNAscope技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外，该产品也可以在Leica以及罗氏Ventana高通量自动平台上运行，为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。

7. 多通道多靶点同时检测：由于RNAscope技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大，故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点；而在荧光检测过程中，可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。

目前在NCBI上，使用RNAscope技术研究长链非编码RNA的文章已有二十余篇。

图1：在对长链非编码RNA BCAR4与乳腺癌的研究中，Yang N的团队通过使用RNAscope技术在人体多种组织内对BCAR4进行定位检测[5]。

图2：Jiangqiang Bao等人使用RNAscope的方法判断小鼠睾丸精原细胞发育过程中长链非编码RNA在细胞核以及细胞浆内的分布情况[6]。

另外，在H19与染色体甲基化调控的研究中，Yingqun Huang等人使用RNAscope荧光原位杂交技术明确了H19在细胞浆中的定位，并进行了后续实验[7]。由此可见在非编码RNA的功能研究中，RNAscope使得lncRNA可视化，为该非编码RNA的功能研究提供了广大的应用前景。

RNAscope延伸技术BaseScope在Pre-miRNA以及circular RNA研究中的应用

作为RNAscope技术产品的延伸，ACD公司对BaseScope的研发致力于在组织细胞内原位检测短序列靶点RNA（小于300bp）。由于BaseScope通常只需要1到3对双Z探针即可实现对目标RNA的检测，使得该技术可以检测超短RNA目标序列。目前已有实验证实BaseScope可以在细胞和组织内定位pre-miRNA的分布。在判断特定组织细胞内环状RNA（circular RNA）以及其线性RNA（liner RNA）的存在和分布状况的研究中，使用特殊设计的探针，可以判断例如脑海马区域特定环装RNA以及线性RNA的存在以及分布比例，为环状RNA的功能研究提供直观的形态学数据。

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Reference:

1. GenesDev. 2006 Jun 1;20(11):1470-84. The Evf-2 noncoding RNA istranscribed from the Dlx-5/6 ultraconserved region and functions as a Dlx-2tranional coactivator.

2. J Neurosci. 2007Aug 15;27(33):8885-92. The brain cytoplasmic RNA BC1 regulates dopamine D2receptor-mediated transmission in the striatum.

3. BMC Genomics. 2015May 14;16:380. Identification of REST targets in the Xenopus tropicalis genome.

4. Nature. 2014 May 15;509(7500):371-5. Reconstructinglineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq.

5. Cell. 2014Nov 20;159(5):1110-25. lncRNA directs cooperative epigenetic regulationdownstream of chemokine signals.

6. BiolReprod. 2013 Nov 7;89(5):107. Print 2013 Nov. Expression profilingreveals developmentally regulated lncRNA repertoire in the mouse male germline.

7. NatCommun. 2015 Dec 21. H19 lncRNA alters DNA methylation genome wideby regulating S-adenosylhomocysteine hydrolase.

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